MICROBIOLOGIA - COLORACIONES

GRAM:

• Preparar un extendido fino del material a colorear y dejar secar al aire.
• Fijar al calor, pasando el preparado 3 o 4 veces dentro de la llama del mechero bunsen.
• Cubrir el portaobjeto con cristal violeta durante 1 min. y lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.
• Cubrir el portaobjeto con solución de lugol durante 1 a 2 min. y lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.
• Sostener el porta-objetos entre el dedo pulgar e índice y decolorar con alcohol-acetona. (10 seg.) La decoloración es el paso más crítico del procedimiento de esta técnica. la tendencia a sobredecolorar hace que bacterias Gram positivas aparezcan Gram negativas.
• Lavar inmediatamente el portaobjetos con agua corriente para remover el alcohol-acetona y frenar la decoloración. Eliminar el exceso de agua.
• Cubrir el frotis con solución de fucsina o safranina durante 30 – 60 seg. Lavar con agua corriente.
• Control: Gram positivo: Staphylococcus aureus
Gram negativo: Escherchia coli

Reactivos:
- Solución 1: sol. madre de cristal violeta. Disolver 10 grs. de colorante en 100ml de alcohol 95%. Guardar en botella de vidrio durante un año.
- Solución de trabajo: filtrar 10 ml de la solución madre y agregar 40 ml de solución recién filtrada de oxalato de sodio al 1% o de H2O dest.
- Lugol: Disolver 25 gr de Iodo cristalino + 50 g IK + 500 ml H2O dest. Guardar botella color caramelo.
- Decolorante: Partes iguales de etanol 95% y acetona. Guardar frasco color caramelo a TA (temperatura ambiente).
- Contracolorante:
a) Safranina: tomar 20 ml de solución de safranina al 2,5 % en etanol 95% y agregar 180 ml de H2O dest.
b) Fucsina básica: disolver 0,1 o o,2 g de fucsina básica en 100 ml de H2O dest. Guardar en botella oscura durante un año.


GRAM WEIGERT

Recomendado para observar quistes de Pneumocystis carinii.

• Fijar con metanol tres minutos.
• Cubrir con eosina amarilla durante 5 minutos.
• Lavar con agua y añadir cristal violeta recién filtrado. Dejar 3 min.
• Lavar con solución de Iodo y dejar con esta misma 5 minutos.
• Lavar con agua, secar cuidadosamente con papel, tanto la parte superior como la inferior del porta-objetos y dejar secar al aire.
• Decolorar con anilina- xileno hasta que no desprenda más color púrpura ( el extendido debe quedar color rosado ).
• Enjuagar con xileno, secar al aire y observar con inmersión.

Los quistes de P. carinii y hongos se tiñen de azul oscuro e irregularmnete. Los núcleos celulares pueden teñirse de azul si no están bien decolorados, pero no son tan oscuros como los quistes de P. carinii.

Reactivos:
- Eosina: Disolver 1g de eosina amarilla en 100 ml de agua dest.
- Cristal violeta: mezclar soloc. A y B . Filtrar antes de usar. Estable por tres meses.
- Solución A: mezclar 2 ml de anilina con 88 ml de agua dest. Filtrar
- Solución B: disolver 5 g de cristal violeta en 10 ml de etanol al 95%.
- Solución de Iodo: 2g de IK + pequeña cantidad de agua dest. Agregar 1 g de iodo y llevar a 300 ml con agua dest.
- Anilina-xileno: mezclar partes iguales de los 2 reactivos.


ZIEHL NEELSEN

• Fijar el extendido por calor
• Cubrir el preparado con sol. de fucsina y calentar el preparado hasta desprendimiento de humos blancos, durante 5 min. Agregar agua si el preparado comienza a desecarse.
• Lavar con agua y decolorar con alcohol ácido .
• Lavar con agua y contracolorear con azul de metileno durante 1 min.
• Lavar y secar al aire. Mirar a 100x.

Reactivos:
- Fucsina:
a) Disolver 3g de fucsina en 10 ml al 95%
b) Disolver 5g de fenol cristalizado en 100 ml .
c) Mezclar 10 ml de soluc. A con 90 ml de soluc. B y guardar a temp. ambiente durante 3 meses.
- Alcohol ácido: 3ml de HCL + 97 ml de “ ol “ al 95%.
- Azul de metileno: 0,3g de azul de metileno + 100 ml agua dest.


TINTA CHINA

• Mezclar una gota de LCR con una gota de tinta china (Pelikan) o nigrosina, sobre un portaobjetos. Si la tinta china está muy concentrada diluir con agua destilada.
• Colocar un cubreobjetos y observar antes que se seque con objetivo de 40 o 100x.
• Permite observar con claridad microorganismos rodeados de cápsula ( por ej. Cryptococcus neoformans ).


KINYOUN

• Fijar los extendidos con metanol.
• Cubrir con carbolfucsina durante 5 min. + calor hasta vapores blancos una vez.
• Lavar con agua. Decolorar con H2SO4 5% 30 – 60 segundos.
• Lavar con agua. Escurrir. Agregar azul de metileno 3 min.
• Lavar secar. Observar a 100x.
• Permite observar Cryptosporidium parvum e Isospora belli ( color rojo a rosado ).

Reactivos
- Solución A: 0,3 g de fucsina + 10 ml de etanol al 95%
- Solución B: 5g de fenol + 100 ml de agua dest. Calentar hasta disolución.
- Mezclar A y B. Conservar a temp amb. Estable 1 año.
- Decolorante: 5 ml H2SO4 (c) + 95 ml de agua destilada
- Azul de metileno: 0,3g de azul de metileno + 100 ml de agua dest.